Min alapul a napjainkban használatos legtöbb genomszekvenálási eljárás?

– A kísérletes tudományokban minden tudásunk releváns voltát alapvetően az határozza meg, hogy milyen módszerekkel értük el az adott eredményeket. Megpróbálunk hipotéziseket felállítani, ezekhez kísérleteket tervezünk, melyekhez különböző módszerek szükségesek. De ha nem ismerjük pontosan a módszert, vagy ha a választott módszer nem megfelelő, akkor a következtetéseink nem lesznek helyesek.

A DNS-szekvenálás nagyon sokat fejlődött az elmúlt évtizedekben, de lényegében továbbra is a Sanger-féle szekvenáláson alapul.

A legtöbb ma használatos módszer, amellyel könnyen és gyorsan meg lehet határozni a nagyon hosszú DNS-szakaszok szekvenciáit – ilyen például az emberi DNS teljes szekvenciája –, továbbra is azon az elven alapul, hogy kettéválasztjuk a két szálat, és az egyiken (ez a templát szál), aminek a szekvenciáját meg akarjuk határozni, egy polimerizációs reakcióval felépítjük a másikat. A DNS szerkezetében a két szálban tárolt információ komplementer, ez abból a tényből adódik, hogy az egyikben lévő bázisok a másikban lévő meghatározott bázisokkal fognak párosodni. Ha feltételezzük, hogy a DNS-ben csak a jól ismert négy bázis van jelen: adenin (A), timin (T), guanin (G) és citozin (C), akkor ez egyben azt jelenti, hogy az adeninnel szemben a timin, a guaninnal szemben a citozin a megfelelő komplementer pár. Ez a Watson–Crick-féle bázispárosodási szabály, amelyet már számos módszerrel meghatároztak és igazoltak. Tehát az előbbi példánál maradva, ha az újonnan szintetizálódó szálban észrevesszük, hogy egy timin fog beépülni, akkor ez azt jelenti, illetve arra következtetünk, hogy azon a pozíción, ahol éppen tart a szintézis, egy adenin van a másik szálon. De vegyük figyelembe azt is, hogy itt már eleve azt feltételeztük, hogy a négy bázison kívül más nem fordul elő a DNS-ben.

Hogyan történik a valóságban a DNS-szekvenálás?

– Először gondoljuk végig, hogy a Sanger-alapú szekvenáláson kívül milyen más lehetőség állna rendelkezésre. Közvetlen módszer lenne például, ha a DNS-szálról egyenként levágnánk egy-egy nukleotidot, és pontos analízissel, például tömegspektrometriával vagy egyéb módon meghatároznánk, hogy éppen mit vágtunk le. Fehérjeszekvenálásban korábban gyakran használták ezt a direkt módszert, de rendkívüli kísérletes nehézséget jelentene ezzel dolgozni hosszú DNS-szálak esetén. Frederick Sanger Nobel-díjat érő ötlete indirekt módszeren alapul. A meghatározandó szálra ráépítjük a komplementer szálat, és ha közben tudjuk követni, hogy mi épült be az első, a második, a harmadik pozícióba és így tovább, akkor megkapjuk a templát szál szekvenciáját. A polimerizációs folyamat követésére Sanger és munkatársai úgynevezett didezoxilánc-terminációs DNS-szekvenálást fejlesztették ki, ami egy egyszerű és rendkívül pontos módszer ahhoz, hogy napi több ezer bázis szekvenciaadathoz hozzájussunk. Ennek a módszernek a variációi rengeteget fejlődtek az utóbbi években, aminek az lett az eredménye, hogy ma már – megfizethető áron – meg lehet határozni bárkinek a genomját.

Alkalmasak-e arra ezek a technológiák, hogy valóban feltérképezhessük a DNS-t?

– Ez a kérdés rávilágít arra, hogy hol is vannak a megismerés határai ebben az esetben. Mindaddig, amíg igaz a feltevés, hogy a DNS-ben csak a négy bázis van jelen, és csak A:T és G:C párok vannak, addig tökéletesek a láncpolimerizáción alapuló módszerek. Időközben azonban kiderült, hogy vannak másféle bázisok is a DNS-ben. Egyéb kémiai karakterizálási kísérletek során például bebizonyosodott, hogy a bázisok egy része metilálva van. Ez azért is volt fontos felfedezés, mert számos biotechnológiai eljáráshoz kötődött. A baktériumoknak például saját immunfunkciója ez a jellegű bázismetilálás. Van egy enzimkészletük, amivel adott szekvenciális környezetben a saját DNS-üket metilálják, és van egy másik, amivel az idegen DNS-t, ami pedig nem így van metilálva, azt lebontják.

A restrikciós metilázok, restrikciós endonukleázok, különösen ez utóbbiak egy olyan biotechnológiai eszközt adtak a kezünkbe, amivel a kémcsőben könnyen és gyorsan el tudjuk vágni a DNS-eket a megfelelő szakaszoknál.

A vágások helyén ragadós végek keletkeznek, így össze lehet illeszteni a kétféle DNS-t, amelyeket ugyanazzal az endonukleázzal vágtunk. A metil-adeninnek pedig ugyanúgy a timin a párja, mint az adeninnek. Így tehát ebben az esetben nem tudhatjuk biztosan, hogy ha az éppen épülő szálban timin van, akkor azzal szemben a templát szálban adenin vagy metiladenin volt-e.

Milyen egyéb példákat ismerünk?

– Kiderült, hogy a citozin bázismetilált formája széles körben elterjedt az élővilágban, és különösen jelentős mennyiségben fordul elő emlős szervezetekben. Emlősökben a citozinmetiláció egy gén előtti szabályozó szakaszban – a promoterben – nagyban csökkenti az adott gén expresszióját, azaz csendesíti a gént. Kiderült az is, hogy különböző rákos betegségekben a metilcitozinok előfordulása nagyban megváltozik, és mind túlzott, mind csökkent metilálás előfordul. Felmerült a logikus és fontos kérdés: hol vannak pontosan a metilcitozinok a genomi DNS-ben? A tudósok ennek meghatározására felfedeztek egy egyszerű kémiai módszert, a nátrium-biszulfitos szekvenálást. Ennek az alapja az, hogy a metilcitozin és a nem metilált citozin másképp reagál, ha nátrium-biszulfitot adnak hozzá. Ez az egyszerű szervetlen anyag átalakítja, dezaminálja a citozint, amiből egy másik bázis lesz: az uracil, ami jelenlegi tudásunk szerint nem természetes alkotója a DNS-nek. A metilcitozin viszont érintetlen marad. Hogy ez használható legyen a szekvenáláshoz kötött sorrend meghatározásában, az uracil egy másféle Watson–Crick-bázispárt képez: míg a citozinnak a guanin a párja, addig az uracilnak az adenin. A timin pedig, aminek az adenin a párja a DNS-ben, úgy néz ki, mint egy metilált uracil.

Ebből mi következik?

– Tudni fogjuk, hogy hol vannak citozinok és metilcitozinok. Ha a templát szálat megszekvenáljuk a szokásos módszerünkkel, a citozinnál és a metilcitozinnál is guanint kapunk. Nátrium-biszulfit hozzáadását követően a citozinok átalakulnak uracillá, de a metilcitozinok nem változnak. Ha ezt megint megszekvenáljuk, azt látjuk, hogy a citozinból átalakult uracil párja már nem a guanin, hanem az adenin, míg a metilcitozinoknál marad a guanin. A módszernek két nagy előnye is van: az egyik az, hogy egyszerű kémiai reakcióval meg lehet különböztetni a két bázist, a másik pedig az, hogy a reakció terméke, az uracil egy olyan bázis, amit értelmezni tud a DNS-polimerizáció, ami nem feltétlenül igaz minden módosított bázisra.

Melyek a lefontosabb területek a DNS-kutatásban?

Napjainkban egy nagyon fontos területnek számít a DNS-ben a nem konvencionális, úgynevezett szokatlan bázisok előfordulása.

Ezek közé tartozik minden olyan bázis, ami eltér a négy Watson–Crick-bázistól. Tömegspektrometriai módszerekkel például kétséget kizáróan kiderült az is, hogy a metilcitozinon kívül ennek oxidált verziói, a hidroximetil-citozin, a formil-citozin és a karboxi-citozin. A metilcitozin oxidációs lánc tanulmányozása során a kutatók arra szeretnének választ kapni, hogy pontosan milyen úton történik meg a DNS-ben előforduló metilcitozinok demetilálása. Mára kiderült, hogy a metilcitozin oxidált formák kulcsszerepet játszanak a folyamatban. A demetilálás akkor kiemelten fontos, ha a szervezet fel akarja szabadítani a génkifejeződés gátlása alól a DNS egy adott szakaszát. Az emlős embrionális fejlődés kezdeti szakaszában, amikor a hím és a női ivarsejt egyesül és zigótát hoznak létre, megfigyelhető egy demetilációs hullám. „Leradíroz” mindent a szervezet, hogy új lappal indulhasson az embrió, majd ezt követően ismételten kialakul a metiláció. Mind az apai, mind az anyai eredetű DNS demetilálódik, jóllehet különböző kinetikával. Nagyon fontos tehát a demetiláció.

Miért lényeges megértenünk a DNS valós kémiai alapját?

– Azért, mert abból eredeztethető minden, ami a sejtben lesz. Nagyon fontos tudnunk tehát, pontosan hogyan néz ki. Ez az elszántság hajtja előre a genomszekvenálási eljárásokat is, hogy végre tényleg megértsük, milyen jellegű a DNS kémiai anyaga, milyen szabályozások kötődnek hozzá, ami aztán elvezet az egyed­fejlődéshez.

Milyen szerepet játszik az uracil a DNS-ben?

– A DNS uracilosításával halálra ítélhetjük a sejteket. Ha gyorsan osztódó sejtekbe olyan gyógyszereket viszünk be, amelyek hatására megjelenik a DNS-ben az uracil, életbe lép egy javító mechanizmus, ami ezeket kihasítja, és a sok vágás miatt a DNS is fragmentálódni fog. A sejtjeinkben a citozin spontán dezaminációja folyamatosan zajlik, mert a DNS makromolekula jelentős kémiai reaktivitással rendelkezik az élő közegben. Ez folyamatos bázis-, azaz információváltozásokat jelent. A stabilitás helyreállítására az egyik nagyon fontos javító mechanizmus alapját, az uracilt kihasító enzimek, az uracil-DNS-glikozilázok adják. A kemoterápiában használatos gyógyszereknek legalább a fele azon az alapon működik, hogy megzavarja a nukleotidszinteket, emiatt a DNS nem helyesen épül fel, így a javító mechanizmusok egy hiábavaló ciklusba kerülnek. A betegségek elleni küzdelemben egyrészt fontos a rák elleni kemoterápiás szerek hatékonyságának a mérése, másrészt annak eldöntése, hogy milyen folyamatokat indít el az uracilosítás.

Érdekes kérdés az is, hogy a DNS-ben lévő uracil az egyedfejlődés során hogyan jelenik meg, és pontosan hol van.

Egy másik kutatási irányunk a patogén mikroorganizmusok vizsgálata. Ezek közül egy nagyon érdekes eukariota egysejtű a könnyen mutálódó Plasmodium falciparum, a malária kórokozója, melynek DNS-ében 90 százalékos az adenin és a timin aránya. Általában nagyjából 50-50 százalék az AT- és a CG-pároknak az aránya, tehát a Plasmodium falciparum rendkívüli módon eltolódott AT-aránnyal rendelkezik. Mivel az uracil egy timinanalóg, ha ez az organizmus ilyen AT-gazdag, akkor könnyen előfordulhat benne az uracilosodás, vagy könnyen előidézhető. A fertőző mikrobák ellen is jól használható módszer a gyorsan osztódó sejtek ellen kifejlesztett technika, ami a nukleotidszintek megzavarásán alapul. Ezért is fontos megértenünk, hogy pontosan hol vannak az uracilok.

Nemzetközi kitekintésben melyek a legérdekesebb kutatási területek?

– Az egyik a paleogenomika tudománya. Svante Pääbo svéd genetikus nyerte a 2022-es orvosi-élettani Nobel-díjat az emberek kihalt elődeinek genomjával és az emberi evolúcióval kapcsolatos felfedezéseiért. Nagyon ősi DNS-szekvencia meghatározásával tudta igazolni a neandervölgyi emberrel való rokonságunkat. Ehhez a felfedezéshez ki kellett dolgoznia a neandervölgyi DNS vizsgálati módszerét, ami egy több évtizeden át tartó munka volt. Különösen fontos szerepet játszott ebben a már említett citozin dezaminálódásból adódó uracilok eltávolítása a csontleletekből izolált DNS-ből.
Szerencsénkre ebben a feltörekvő tudományágban, a paleogenomikában Magyarországon is vannak kiváló szakemberek. Régészethez kötődő genomikával hosszú ideje foglalkoznak a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Genetikai Intézetében, ahol eredetileg Raskó István vezetésével indultak el az ilyen irányú kutatások. Olyan kérdésekre is választ adnak ezek a kutatások, hogy őseink milyen anyagcserével rendelkeztek.

Szintén fontos terület az onkogenomika, a rákhoz kapcsolódó DNS-kutatások, az egyedi hajlamok feltárása és a génterápia. Számos kutatócsoport fő­ként molekuláris genetikai módszerekkel vizsgálja modellszerve­ze­tekben az egyedfejlődés, az immunitás, a daganatképződés és a DNS-hibajavítás folyamatait. Másrészt biotechnológiai szempontból kiemelt figyelmet érdemel a CRISPR génszerkesztő el­járás, amely elméletileg jól alkalmazható a feltárt DNS-beli problémák kija­vítására.•